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原代MEF细胞分离培养

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1 材料
1.1 动物
孕期14至16天的孕鼠(小鼠)。
1.2 试剂
无Ca2+和Mg2+的PBS(D-PBS)、0.05%胰酶、0.53 mmol/L EDTA溶液、MEF生长培养基(高糖DMEM加10%FBS)。
1.3 器械
眼科直剪3把、眼科直镊3把、眼科弯镊2把、玻璃平皿3套、200目尼龙滤网、50 ml和15 ml离心管和手术刀片。以上物品均需要高压灭菌消毒处理。

2 方法
2.1 处死孕鼠,全身置于75%酒精里浸泡,然后在超净台中用剪刀和镊子将孕鼠皮肤剪开,用另外一组剪刀、镊子剪开腹部肌层,露出子宫,最后用第三组剪刀和镊子将子宫小心取出放在盛有D-PBS的玻璃平皿中,冲洗去血。
2.2 用两把弯镊子将胚胎外的胞膜小心去除,然后夹掉头和内脏,将其余胚胎转移到一个装有30 ml D-PBS的50 ml离心管中,轻轻颠倒两次,倒掉D-PBS,再重复此步骤一次,注意要留少许D-PBS,然后将胚胎转移到另一装有D-PBS的平皿中,并用手术刀片将其细细切碎。
2.3 用200 μl的移液枪反复、快速地吹打平皿中的液体,转移至15 ml离心管中,于4℃ 1500 rpm离心5分钟,倒掉上清,以10 ml胰酶重悬沉淀,放在37℃水浴中消化30分钟,且每隔五分钟轻轻晃动,使之充分消化。
2.4 将上层细胞悬液倒入一个装有10 ml MEF生长培养基的50 ml离心管中,用200目的尼龙网过滤后,以1500 rpm离心5分钟收集细胞,再用30 ml MEF生长培养基洗涤两次。
2.5 细胞沉淀用15 ml MEF生长培养基重悬后进行细胞计数(一般8只14天的胎鼠可获得2-3×107细胞)。
2.6 3×106细胞悬浮于15 ml MEF生长培养基中,接种到200 ml培养瓶中。
2.7 24小时后更换新鲜的MEF生长培养基。
2.8 细胞长满后,先用D-PBS冲洗,倒掉后加胰酶消化(此步时间不宜过长,作者一般不超过五分钟),按1:5传代。
2.9 细胞再次长到覆盖率80-90%左右,将其消化后,常规冻存(冻存液要现配)[1]。

3 结果

见下图:

4 讨论
4.1 原代培养,一定要避免污染。
4.2 MEF生存能力有限,如果不冻存,体外存活十代左右。
4.3 冻存后复苏的细胞只能传代一次,因为这些细胞繁殖能力有限。
4.4 消化细胞时间不要过长。

还能提供原代MEF细胞的永生化服务,详情请联系我们。

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