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软琼脂成瘤实验

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软琼脂原理:
细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数,但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。由于细胞生物学性状不同,细胞克隆形成率差别也很大,一般初代培养细胞克隆形成率弱,传代细胞系强;二倍体细胞克隆形成率弱,转化细胞系强;正常细胞克隆形成率弱,肿瘤细胞强。并且克隆形成率与接种密度有一定关系,做克隆形成率测定时,接种细胞一定要分散成单细胞悬液,直接接种在碟皿中,持续一周,随时检查,到细胞形成克隆时终止培养。
软琼脂基本步骤:
(1)取对数生长期细胞,用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打,使之成为单细胞,作活细胞计数,用含20%胎牛血清的DMEM培养液调整细胞密度至1×106细胞/L。然后根据实验要求作梯度倍数稀释。

(2)用蒸馏水分别制备出1.2%和0.7%两个浓度的低溶点琼脂糖液,高压灭菌后,维持在40℃中不会凝固。

(3)按1:1比例使1.2%的琼脂糖和2×DMEM培养基(含有2×抗生素和20%的小牛血清)混合后,取3mL混合液注入直径6cm平皿中(10cm平皿加7~10mL),冷却凝固,可作底层琼脂置CO2温箱中备用。

(4)按1:1比例让0.7%的琼脂糖和2×DMEM培养基在无菌试管中相混以后,再向管中加入0.2mL的细胞悬液,充分混匀,注入铺有1.2%琼脂糖底层平皿中,逐形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后,置入37℃ 5%CO2温箱中培养10~14天。

(5)把平皿放置在倒置显微镜下,观察细胞克隆数。计算形成率。

软琼脂培养法常用检测肿瘤细胞和转化细胞系。试验中琼脂与细胞相混时,琼脂温度不宜超过40℃。接种细胞的密度每平方厘米不超过35个,一般6cm的平皿接种1000个细胞。正常细胞在悬浮状态下不能增殖,不适用于软琼脂克隆形成试验。

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